猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)隶属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.)，为多年生雌雄异株落叶藤本植物(黄宏文等, 2000)。根据猕猴桃属分类的最新修订，猕猴桃属有54个种，21个种下分类(Li and Li, 2010)。

红肉猕猴桃是中华猕猴桃的一个变种(王明忠等, 2006, 中国果树, 1: 10-12)，是中国特有的珍贵稀有野生猕猴桃资源。四川省自然资源科学研究院从中华猕猴桃实生苗中选育出世界上第一个红肉猕猴桃品种“红阳”，该品种果实子房鲜红色，横切面果肉呈红、黄绿相间图案，具有特殊的佐餐视觉价值，营养丰富、品质优良，果实较耐贮藏，填补了世界猕猴桃红肉品种的空白(李明章等, 2011)。

在植物学性状的比较分析中，形态学方法是最传统的方法，标记简单、直观、容易获得，在猕猴桃研究中应用广泛。染色体的结构和数量特征是常见的细胞学标记，通过研究植物的染色体可为品种分类和鉴定提供可靠的依据，也为物种演化及亲缘关系的研究提供重要的资料(王荣邦等, 2010)。染色体倍性分析现已被广泛应用于猕猴桃遗传育种研究中(熊治廷等, 1998; 曾华等, 2009)。ISSR标记是由Ziet kiewicz等于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记(Zietkiewicz et al., 1994; Godwin et al., 1997)，已被作为有用的遗传标记用于种质资源鉴定(Escandón et al., 2007)、遗传图谱构建(Bornet and Branchard, 2001; Sankar and Moore, 2001)、基因定位(Ratnaparkhe et al., 1998)、遗传多样性(Luan et al., 2006)等研究中。邱游等利用ISSR标记对14个猕猴桃品种进行了遗传多样性分析，证明猕猴桃品种间遗传距离与地理分布有一定关系(邹游等, 2008)。

本实验以红肉猕猴桃品种红阳为对照，应用生物学特性调查、体细胞染色体数目的观察和ISSR标记分析，对红肉猕猴桃新品系SF-HY-0201形态水平、细胞水平和分子水平的遗传特性进行了检测和比较，为充分利用该优良种质资源提供了理论依据，也为红肉猕猴桃育种和杂交亲本的选择提供新的优良材料。

1结果与分析
1.1 SF-HY-0201与HY花的生物学特性比较
从表1可以看出，SF-HY-0201和红阳的雌花都是单花序，单花序中的有效花数均为1，花萼、花丝、花药、花柱颜色均分别为绿色、淡绿色、黄色和白色，花瓣近轴侧颜色(内侧)均为单色，花瓣颜色均有梯度，花柱姿态均为斜生。与红阳相比，SF-HY-0201花瓣基部萼裂处花青素着色程度较深，花瓣顶部波皱度较轻；SF-HY-0201花瓣基部排列离合情况为接，红阳为叠；SF-HY-0201花瓣内侧主色为白色，红阳为黄色；SF-HY-0201花瓣颜色分布顶端淡，而红阳基部淡。SF-HY-0201的花萼数和花柱数显著低于红阳，花直径极显著高于红阳(表2)。
 

1.2 SF-HY-0201与HY叶的生物学特性比较
由表3可知，SF-HY-0201成叶正面中度绿色，几乎无茸毛，成叶背面浅绿色，成叶叶形阔卵形，成叶叶柄比率0.65；而红阳成叶正面深绿色，茸毛密度无或极稀，成叶背面中度绿色，成叶叶形阔卵圆形，成叶叶柄比率0.50。SF-HY-0201与红阳叶的其它生物学特性均相同或相近。
 

 
1.3 SF-HY-0201与HY果的生物学特性比较
由表4可知，除了果毛分布均主要在果实顶部外，SF-HY-0201与红阳的其它果实外观品质特性均不相同。SF-HY-0201的单果重显著高于红阳，其采收时硬度极显著高于红阳(表5)。由农业部食品质量监督检验测试中心(成都)测定SF-HY-0201果实的Vc含量高于红阳，而总酸、总糖和可溶性固形物(%)含量均低于红阳(表6)。由表7可知，在储藏91 d后，SF-HY-0201的果实出现斑点所占百分比低于红阳，其腐烂果所占百分比和果实硬度则高于红阳。
 

 
1.4染色体倍性分析
利用去壁低渗法对SF-HY-0201和红阳进行染色体倍性鉴定，观察其染色体中期图(图1)。其中SF-HY-0201 (图1A)和红阳(图1B)的染色体均为2n=2x=58，都是二倍体。
 

 
1.5 ISSR分析
100对ISSR引物对红阳与SF-HY-0201基因组DNA进行PCR扩增，筛选出7对带型好、多态性高、重复性好的引物，并经多次实验确定其最适退火温度。7对ISSR引物的扩增结果见表8，共扩增出56条带，其中多态性条带27条，平均多态性比率达48.21%，各引物扩增的多态性条带数在1~8条之间，能揭示红阳与SF-HY-0201间的遗传差异。引物841的扩增图见图2。
 

 
2讨论
猕猴桃属植物的植株、花器、果实等形态特征，以及开花结果习性等均有较大差异，为良种选择和杂交亲本的选择提供了丰富的材料(韩礼星等, 1998, 果树科学, 15(3): 273-276)。本实验对SF-HY-0201和红阳的生物学特性进行了检测，揭示了两者形态水平的真实遗传差异，为猕猴桃育种和杂交亲本的选择提供依据。从实验结果可以看出，与红阳相比，SF-HY-0201果顶部形状浅凹，果皮更粗糙，更抗病虫害和耐碰撞；其平均单果重显著高于红阳，具有更好的商业价值；其Vc含量高于红阳，因此营养价值和品质更高；其总糖含量与红阳接近，而总酸含量低于红阳，因此口感更甜更好。由此可见，SF-HY-0201的许多性状优于传统红肉猕猴桃品种红阳，有希望选育成优良的红肉猕猴桃新品种，或为红肉猕猴桃育种和杂交亲本的选择提供新的优良材料。

种质资源的倍性鉴定是杂交育种的基础研究，有助于杂交组合的筛选，对于杂种F1代的染色体倍性鉴定是育种工作中的重要环节，提前鉴定杂种苗的染色体可有效减少杂交育种的工作量(王荣邦等, 2010)。本实验通过染色体倍性分析检测出SF-HY- 0201和红阳均为2n=2x=58，都是二倍体。SF-HY- 0201是通过自然授粉的红阳F1代杂种实生苗选育出的红肉猕猴桃新品系，其母本为红阳，父本尚不清楚，由此可以推测其父本可能为二倍体。对SF-HY- 0201和红阳进行染色体观察和分析，将加深对猕猴桃属植物进化及亲缘关系的认识，为红肉猕猴桃的开发利用和品种选育提供有利的细胞学证据。

由于ISSR标记多态性水平高，易于分析，不受环境影响，所以已广泛应用于各类植物的品种(系)间的鉴别和分类(朴红梅等, 2007, 吉林农业科学, 32(5): 28-30)。在本实验中，7对ISSR引物能够检测到SF-HY-0201与红阳间的多态性，表明SF-HY-0201与红阳在DNA水平上存在真实的遗传差异。选择合适的ISSR引物，可将SF-HY-0201和红阳在分子水平上进行区分。获得的ISSR电泳图谱可作为DNA指纹图谱，用于SF-HY-0201和红阳的品种(系)认定与纯度检验，并为利用红肉基因的分子标记进行辅助选择奠定基础。

3材料和方法
3.1材料
以种植于四川省自然资源科学研究院什邡猕猴桃研究基地的红肉猕猴桃新品系SF-HY-0201和红肉猕猴桃品种红阳(HY)为供试材料。SF-HY-0201是从红阳F₁代杂种实生苗中选育出的遗传性状稳定、表现优良的红肉猕猴桃新品系。

3.2生物学性状调查
参照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试标准 猕猴桃属》(GB/T XXXX-2004, 审批稿)，分别取SF-HY-0201和红阳各30株进行生物学性状调查。

随机取不同单株的20朵雌花，调查花序数、单花序中的有效花数、花瓣基部萼裂处花青素着色程度、花瓣内侧主色、花瓣近轴侧颜色(内侧)、花瓣颜色梯度、花瓣颜色分布、花瓣基部排列离合情况、花瓣顶部波皱度、花萼颜色、花丝颜色、花药颜色、花柱颜色、花柱姿态等花的生物学特性。

随机取不同单株的20片叶，观察单株的幼叶叶柄正面花青素着色、幼叶尖端形状、幼叶基部形状、成叶正面茸毛密度、成叶背面茸毛密度、成叶正面波皱度、成叶正面绿色度、成叶背面绿色度、成叶叶柄比率、成叶叶形等叶的生物学性状。

每个单株随机取3个果，调查果皮是否光滑、果毛分布、去除绒毛的难易、果形、果形指数、果顶部形状、果实横切面形状、外中内果皮颜色、果心大小、木质部、果实横切面红色等级、单果重、干物质含量、采收时硬度、Vc (mg/100g)、总糖(%)、总酸(%)、维生素C (mg/100g)、可溶性固形物(%)，以及果实储藏性等指标。

果实横切面红色等级参照新西兰皇家科学院植物与食品研究院和四川省自然资源科学研究院制定的评价标准。

干物质含量的测定：称取15 g鲜果肉，恒温干燥箱65℃烘24 h后称重。干物质含量(%)=干重/鲜重×100%。

总糖(%)、总酸(%)、维生素C (mg/100g)、可溶性固形物(%)由农业部食品质量监督检验测试中心(成都)测定。

用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，花柄长、花直径、花萼数、花柱数、单果重、干物质含量和采收时硬度实验数据均以均数±标准差(±s)表示，采用t检验进行组间比较。

3.3染色体数目的观察
取新萌发的茎尖1 cm，在0.002 mol 8-羟基喹啉预处理2~3 h后，蒸馏水冲洗，前低渗30 min处理后，用固定液冲洗置换，并在0~4℃处理12 h，从95%~ 70%的乙醇梯度置换，每次置换停留20~30 min，最后保存在70%的乙醇中备用。在35℃~37℃水浴用混合酶液处理120 min，吸出酶液，加入蒸馏水浸泡0.5 h，吸去蒸馏水，加入固定液后固定20 min，用Giemsa染色30 min，制片镜检，选取良好的分裂相进行显微摄影，采用Levan等的标准进行染色体数目分析(Levan et al., 1964)。

3.4 ISSR标记
DNA提取采用魏艳霞改良CTAB法(魏艳霞等, 2008)，并对DNA的浓度及纯度进行测定。选用100对ISSR引物，参照邱丽娜优化的红肉猕猴桃ISSR- PCR体系进行扩增(邱利娜等, 2010)，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外透射仪上观察并拍照。统计ISSR扩增引物在琼脂糖凝胶上同一位置条带出现的有无，有记为1，无记为0。统计结果录入Excel表格，建立ISSR扩增谱带数据矩阵，求出多态性位点数。

作者贡献
谢玥、潘美玲是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成数据分析，论文初稿的写作；庄启国、王丽华、郑晓琴、廖明安参与实验设计，试验结果分析；李明章是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家科技部项目(2009DFA30870)、四川省国际科技合作与交流研究计划项目和四川省省属科研机构基本科研业务费项目共同资助。

参考文献
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